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Bollenti Spiriti

Quello che abbiamo fatto fin qui con il nostro progetto...

21 Set
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  Il progetto presentato dal nostro gruppo consiste nello sviluppo di un protocolllo sperimentale che consenta di miniaturizzare il sistema di analisi enzimatica funzionale senza perdere in accuratezza di determinazione con l'intento di ridurre ad una minuta quantità il materiale bioptico minimizzando in tal modo l'invasività del prelievo.

In questi primi mesi è stato innazitutto messo a punto un protocollo sperimentale per l'isolamento e l'analisi dei mitocondri, utilizzando come materiale di partenza biopsie di fegato di topo. Sono stati valutati diversi metodi per l'isolamento dei mitocondri, selezionando infine quello che meglio consentiva di preservarne l'integrità e la funzionalità. Il passo successivo è stato la scelta del supporto di analisi, ottimizzato in modo da consentire una adesione dei mitocondri sufficiente per poterli sottoporre alle successive indagini e all'osservazione microscopica.

La prima analisi effettuata è stata la valutazione della capacità mitocondriale di generare potenziale elettrochimico per monitorare lo stato funzionale dei complessi respiratori e dell'ATP-sintasi. A tal fine è stata impiegata la sonda fluorescente TMRE (Tetra Metil Rodamina Estere), un catione lipofilo che viene accumulato "elettroforeticamente" dal potenziale mitocondriale (180-200 mV) raggiungendo concentrazioni locali 3 ordini di grandezza superiori a quelle presenti in soluzione. Mediante l'impiego di tecniche di microscopia a fluorescenza è stato quindi possibile visualizzare l'accumulo della sonda fluorescente, valutando la funzionalità mitocondriale per la prima volta a livello di singolo organello. I mitocondri, chiaramente risolti, appaiono rotondeggianti con un diametro medio di 1 micrometro e con un sistema di fosforilazione ossidativa attivo, come confermato dai risultati delle analisi condotte in presenza di vari substrati specifici quali glutammato/malato, succinato, ascorbato/TMPD. Tale approccio permette di isolare funzionalmente settori distinti della catena respiratoria così da individuarne specifiche alterazioni. Il metodo di processamento del campione biologico messo a punto è pertanto adeguato e affidabile, poiché consente di preservare l'integrità e la funzionalità dei mitocondri, requisito essenziale per la loro analisi e per qualunque valutazione di carattere diagnostico.

Attraverso l'impiego di un'altra sonda fluorescente legante le membrane mitocondriali, la NAO (nonyl-Acridine-Orange), è stato inoltre possibile valutare modificazioni morfologiche mitocondriali in risposta a stimoli apoptogenici o a stress osmotici.

Molte delle patologie mitocondriali congenite o acquisite sono legate ad un' alterazione del Complesso I, mimabile attraverso il trattamento del campione biologico con un inibitore specifico di questo complesso multienzimatico, il rotenone.

L'analisi sulla preparazione di mitocondri isolata da fegato di ratto effettuata in microscopia confocale con la sonda di potenziale transmembranario TMRE in presenza di concentrazioni crescenti di rotenone, ha evidenziato la sensibilità del metodo messo a punto nel rilevare deficit funzionali del complesso I sia di lieve che di grave entità.

Il progetto proseguirà analizzando con lo stesso approccio l'attività degli altri complessi della catena respiratoria mitocondriale per poi passare a testare il metodo su campioni bioptici muscolari o cutanei prelevati da soggetti umani sani reclutati in collaborazione con il servizio ospedaliero-universitario locale e successivamente a validarlo su campioni biologici di pazienti affetti da patologie con documentata specifica disfunzione mitocondriale.

Letto 2457 volte Ultima modifica il Lunedì, 21 Settembre 2009 22:52

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